Projektas „Vienos molekulės TOP-seq- inovatyvi technologinė platforma ankstyvai neinvazinei vėžio ir kitų epigenetinių susirgimų diagnostikai" (Nr. 09.3.3-LMT-K-712-01-0041). Projektas finansuojamas Europos Socialinio fondo lėšomis pagal Priemonės Nr. 09.3.3-LMT-K-712 veiklą ,,Mokslininkų kvalifikacijos tobulinimas vykdant aukšto lygio MTEP projektus “
Projekto vykdymo laikotarpis: 2018-01-08 - 2022-01-07
Projekto vadovė – dr. Edita Kriukienė.
Santrauka. Projekto tikskas – sujungiant pažangias mikroskysčių technologijas ir unikalią kryptingą DNR modifikacijų sekoskaitą sukurti nemodifikuotų CG ir hmCG nustatymo kiekvienoje lcDNR molekulėje metodą ir jį pritaikyti tiesiosios žarnos vėžio (TŽV) epigenetinių haplotipų ir jų variabilumo diagnostikai iš plazmos lcDNR.
Kuriamas metodas – vienos molekulės TOP-seq (vmTOP-seq) paremtas tyrimo grupės narių anksčiau sukurtomis unikaliomis technologijomis bei kompetencijomis: kryptingu kovalentiniu DNR sekų žymėjimu, kryptinga kovalentinio žymėjimo nulemta sekoskaita TOP-seq bei mikroskysčių technologijomis. Panaudosime mūsų anksčiau sukurtas nemetilintų ir hidroksimetilintų CG kovalentinio žymėjimo technologijas. Pasitelkę pažangią mikroskysčių technologiją ir nukleorūgščių barkodavimo principus nustatysime atskirų lcDNR molekulių nemetilintų CG/hmC žemėlapius ir nustatysime kiekvienos molekulės modifikacijų haplotipus. Mikroskysčių technologija dėl savo didelio našumo yra sėkmingai pritaikyta vienos ląstelės tyrimuose, barkoduojant atskiras ląsteles ir nustatant dešimčių tūkstančių individualių ląstelių RNR profilius ar chromatino struktūrą, bet DNR molekulių modifikacijos nebuvo tirtos. Pirmą kartą atliksime didelio našumo DNR modifikacijų analizę pritaikydami mikroskysčius bei sukursime metodą pavienių lcDNR molekulių analizei vėžio diagnostikos tikslams.
Analizuodami pavienes molekules įvertinsime pakitusių meH haplotipų frakciją ir pagal meH nustatysime šios DNR frakcijos audinio kilmę. vmTOP-seq galima dirbti su labai mažais paprastai brangios lcDNR kiekiais (~1 ng): naudojamos švelnios fermentinio / cheminio žymėjimo sąlygos, todėl šis metodas nedegraduoja ir išsaugo visą įmanomą lcDNR kiekį. Yra žinoma, kad vėžinės kilmės DNR būdingas globalus hipometilinimas, lyginant su kraujo ląstelių DNR hipermetilinimu, todėl šis metodas, kuris analizuoja nemodifikuotą DNR frakciją, yra ypač vertingas tiriant vėžinę DNR. Kombinuotas CG ir hmCG tyrimas dar labiau sustiprins vėžinių pokyčių nustatymą. O vmTOP-seq atliekama atskirų molekulių analizė leis atskirti DNR modifikavimo ir DNR kopijų kiekio pakitimus, kurie dažnai yra būdingi vėžinėms ląstelėms.
Siekiamas rezultatas: Tai bus pirmasis toks metodas, kuriame yra chemiškai pažymimas kiekvienas nemodifikuotas ir hidroksimetilintas CG ir analizuojami jų haplotipai atskirose lcDNR molekulėse. vmTOP-seq bus vykdomas tikslus ir ekonomiškas lcDNR sudarančių audinių nustatymas. Šį metodą pritaikysime TŽV analizei ir sukursime technologinį pagrindą TŽV diagnostikai iš lcDNR.