Sidebar

Baltymų-nukleorūgščių sąveikos tyrimų skyrius

Tyrimų kryptys

Visos gyvybės formos nuo bakterijų iki žinduolių yra potencialūs virusų taikiniai. Bakterijų virusai (bakteriofagai) gali sunaikinti ištisas bakterijų populiacijas. Evoliucijos eigoje bakterijos sugebėjo išlikti sukurdamos gynybos sistemas, kurios saugo ląsteles nuo bakteriofagų ir svetimų nukleorūgščių patekimo. Kadangi bakteriofagai gali daugintis tik ląstelėje, jie kinta, ieškodami būdų, kaip įveikti ląstelių gynybos barjerus, o bakterijos priverstos kurti naujas apsaugos sistemas.

Daug žmogui naudingų produktų, pavyzdžiui, pieno produktai, bioaktyvūs junginiai ir vaistai gaminami panaudojant bakterijas. Tokioje gamyboje bakteriofagų infekcijos yra labai pavojingos, nes gali sunaikinti visą bakterijų populiaciją, todėl pramonėje  reikalingi bakterijų kamienai, turintys efektyvias antivirusinės apsaugos sistemas. Norint sukurti tokius bakterijų kamienus laboratorijoje, reikia suprasti, kaip veikia antivirusinės apsaugos sistemos.

Mūsų skyrius tiria fermentus ir jų kompleksus, kurie atsakingi už bakterijų apsaugą nuo svetimų nukleorūgščių. Labiausiai mus domina restrikcijos endonukleazių bei CRISPR molekulinio aparato struktūra ir veikimo mechanizmas. Tyrimams naudojame rentgenostruktūrinę analizę, mutagenezę, biocheminius ir biofizikinius tyrimo metodus.

Publikacijos

2017 m.  

Sasnauskas G, Tamulaitiene G, Tamulaitis G, Calyševa J, Laime M, Rimšeliene R, Lubys A, Siksnys V. UbaLAI is a monomeric Type IIE restriction enzyme. Nucleic Acids Res. 2017 Sep 19;45(16):9583-9594. doi: 10.1093/nar/gkx634. PMID: 28934493

Toliusis P, Zaremba M, Silanskas A, Szczelkun MD, Siksnys V. CgII cleaves DNA using a mechanism distinct from other ATP-dependent restriction endonucleases. Nucleic Acids Res. 2017 Aug 21;45(14):8435-8447. doi: 10.1093/nar/gkx580. PMID: 28854738

Kazlauskiene M, Kostiuk G, Venclovas Č, Tamulaitis G, Siksnys VA cyclic oligonucleotide signaling pathway in type III CRISPR-Cas systems. Science. 2017 Aug 11;357(6351):605-609. doi: 10.1126/science.aao0100. Epub 2017 Jun 29. PMID: 28663439

Karvelis T, Gasiunas G, Siksnys V. Harnessing the natural diversity and in vitro evolution of Cas9 to expand the genome editing toolbox. Curr Opin Microbiol. 2017 Jun;37:88-94. doi: 10.1016/j.mib.2017.05.009. Epub 2017 Jun 20. Review. PMID: 28645099

Kostiuk G, Dikic J, Schwarz FW, Sasnauskas G, Seidel R, Siksnys V. The dynamics of the monomeric restriction endonuclease BcnI during its interaction with DNA. Nucleic Acids Res. 2017 Jun 2;45(10):5968-5979. doi: 10.1093/nar/gkx294. PMID: 28453854

Karvelis T, Gasiunas G, Siksnys V. Methods for decoding Cas9 protospacer adjacent motif (PAM) sequences: A brief overview. Methods. 2017 May 15;121-122:3-8. doi: 10.1016/j.ymeth.2017.03.006. Epub 2017 Mar 24. Review. PMID: 28344037

Tamulaitiene G, Jovaisaite V, Tamulaitis G, Songailiene I, Manakova E, Zaremba M, Grazulis S, Xu SY, Siksnys V. Restriction endonuclease AgeI is a monomer which dimerizes to cleave DNA. Nucleic Acids Res. 2017 Apr 7;45(6):3547-3558. doi: 10.1093/nar/gkw1310. PMID: 28039325

Tamulaitis G, Venclovas Č, Siksnys V. Type III CRISPR-Cas Immunity: Major Differences Brushed Aside.

Trends Microbiol. 2017 Jan;25(1):49-61. doi: 10.1016/j.tim.2016.09.012. Epub 2016 Oct 20. Review. PMID: 27773522

Tutkus M, Sasnauskas G, Rutkauskas D. Probing the dynamics of restriction endonuclease NgoMIV-DNA interaction by single-molecule FRET. Biopolymers. 2017 Dec;107(12). doi: 10.1002/bip.23075. Epub 2017 Oct 27. PMID: 29076526

Tutkus M, Marciulionis T, Sasnauskas G, Rutkauskas D. DNA-Endonuclease Complex Dynamics by Simultaneous FRET and Fluorophore Intensity in Evanescent Field.

Biophys J. 2017 Mar 14;112(5):850-858. doi: 10.1016/j.bpj.2017.01.017. PMID: 28297644

Mickevičiūtė A, Timm DD, Gedgaudas M, Linkuvienė V, Chen Z, Waheed A, Michailovienė V, Zubrienė A, Smirnov A, Čapkauskaitė E, Baranauskienė L, Jachno J, Revuckienė J, Manakova E, Gražulis S, Matulienė J, Di Cera E, Sly WS, Matulis D. Intrinsic thermodynamics of high affinity inhibitor binding to recombinant human carbonic anhydrase IV. Eur Biophys J. 2017 Oct 3. doi: 10.1007/s00249-017-1256-0. [Epub ahead of print]. PMID: 28975383

Zubrienė A, Smirnov A, Dudutienė V, Timm DD, Matulienė J, Michailovienė V, Zakšauskas A, Manakova E, Gražulis S, Matulis D. Intrinsic Thermodynamics and Structures of 2,4- and 3,4-Substituted Fluorinated Benzenesulfonamides Binding to Carbonic Anhydrases. ChemMedChem. 2017 Jan 20;12(2):161-176. doi: 10.1002/cmdc.201600509. Epub 2016 Dec 21. PMID: 28001003

Long F, Nicholls RA, Emsley P, Gražulis S, Merkys A, Vaitkus A, Murshudov GN. AceDRG: a stereochemical description generator for ligands. Acta Crystallogr D Struct Biol. 2017 Feb 1;73(Pt 2):112-122. doi: 10.1107/S2059798317000067. Epub 2017 Feb 1. PMID: 28177307

Long F, Nicholls RA, Emsley P, Gražulis S, Merkys A, Vaitkus A, Murshudov GN. Validation and extraction of molecular-geometry information from small-molecule databases. Acta Crystallogr D Struct Biol. 2017 Feb 1;73(Pt 2):103-111. doi: 10.1107/S2059798317000079. Epub 2017 Feb 1. PMID: 28177306

Merkys A, Mounet N, Cepellotti A, Marzari N, Gražulis S, Pizzi G., J Cheminform. A posteriori metadata from automated provenance tracking: integration of AiiDA and TCOD. 2017 Nov 14;9(1):56. doi: 10.1186/s13321-017-0242-y. PMID: 29138947


Projektai ir bendradarbiavimas

CRISPR/Cas sistemų struktūros ir molekulinių mechanizmų tyrimai

Neseniai atrasta nauja bakterijų apsaugos nuo bakteriofagų ir plasmidžių DNR sistema CRISPR (angl. „Clustered regularly interspaced short palindromic repeats“) veikia panašiai kaip eukariotinių organizmų imuniteto sistema. CRISPR sistemos plačiai paplitusios ir randamos tiek prokariotiniuose organizmuose, tiek archėjose. CRISPR sritį genome sudaro trumpi (21–49 bp ilgio) dalinai palindrominiai DNR pasikartojimai (gali būti nuo 2 iki 250 pasikartojimų). Tarp pasikartojančių DNR sekų yra įsiterpusios unikalios DNR sekos – skirtukai (angl. spacers), kurie būna 20–58 bp ilgio. Šalia CRISPR srities, genome yra išsidėstę Cas (CRISPR-associated) genai (nuo 3 iki 10), kurių koduojami baltymai dažnai turi funkcinius domenus, būdingus nukleazėms, helikazėms, polimerazėms ir kitiems su nukleorūgštimis sąveikaujantiems baltymams. 

CRISPR/Cas sistema suteikia šeimininko ląstelei atsparumą bakteriofagams ir kitai „svetimai“ nukleorūgščiai. Bakteriofagui ar plazmidei patekus į ląstelę, kai kurios bakterijos sugeba įsistatyti į savo genomą naujus skirtukus, kurie yra identiški bakteriofago ar plazmidės DNR sekoms. Tokios pasikeitusios bakterijos įgyja atsparumą tam fagui ar plazmidei, kurio DNR fragmentus įsistatė į savo genomą. Šio reiškinio molekuliniai mechanizmai kol kas neišaiškinti. Nežinoma, nei kaip atpažįstama „svetima“ bakteriofago ar plazmidės DNR, nei kaip įsistatomas naujas skirtukas, nei kaip jis parenkamas. Būtent šie mechanizmai tiriami mūsų skyriuje.

Restrikcijos endonukleazių struktūros ir veikimo mechanizmų tyrimai

Restrikcijos ir modifikacijos (RM) sistemos yra vienas iš ginklų, kurį bakterijos ląstelė naudoja apsaugai nuo svetimos DNR ir bakteriofagų antpuolio. RM sistemos paprastai susideda iš dviejų fermentų: restrikcijos endonukleazės (REazės) bei metiltransferazės (MTazės). REazė karpo tik „svetimą“ DNR, bet neliečia „savos“, nes greta esanti MTazė pažymi „savo“ DNR įvesdama į REazės taikinį metilo grupę. Šiuo metu  aprašyta per 330 skirtingų specifiškumų REazių iš 4000 bakterijų rūšių. Šie fermentai yra nepakeičiami įrankiai laboratorijoje, nes veikia kaip „molekulinės žirklės“, kurios karpo DNR. Įdomu, kad tą pačią funkciją atliekančios REazės pasižymi didele tiek struktūrų, tiek DNR kirpimo mechanizmų įvairove. Svarbiausi klausimai, į kuriuos norime rasti atsakymą tirdami REazes, yra šie:

Kaip restrikcijos fermentai atpažįsta „savo“ specifines sekas?
Kokie bendri struktūriniai ir molekuliniai mechanizmai sieja restrikcijos fermentus, atpažįstančius giminingas DNR sekas?
Kaip DNR atpažinimas susijęs su katalize?
Ar galima sukurti naujus restrikcijos fermentus, supratus jų sandarą ir veikimo principus?

Atsakymų į šiuos klausimus ieškome pasitelkdami baltymų-DNR kompleksų rentgenostruktūrinę analizę, kryptingą mutagenezę ir biocheminius metodus.

Atvira kristalografijos duomenų bazė

Ši kristalografijos duomenų bazė (angl. Crystallography Open Database, COD) gali būti naudojama kaip priemonė identifikuoti kristalines medžiagas, kaip duomenų šaltinis baltymų molekulių struktūroms patikslinti, kaip mokymo priemonė studentams. Ši duomenų bazė taip pat gali tapti įrankiu, padedančiu iškart nustatyti kasykloje paimto mėginio uolienas, mineralus, naudingąsias iškasenas. Ji tapo bene didžiausiu pasaulyje atviru cheminės kristalografijos resursu, jau sukaupta per 350 tūkst. įrašų.

Duomenų bazės svetainė atvirai prieinama internete ir leidžia ieškoti duomenų pagal pagrindinius kristalografinius ir cheminius parametrus (paieškos svetainę sukūrė Armelis Le Bailas ir Michaelis Berndtas), peržiūrėti surastas struktūras tiesiog naršyklėje arba nusikelti jas į vietinį kompiuterį tolimesnei analizei. Be to, registruoti naudotojai gali įkelti į duomenų bazę naujas struktūras, tiek jau publikuotas mokslo spaudoje, tiek ruošiamas publikacijai ar pateikiamas kaip asmeniniai pranešimai COD. Įkėlimui naudojama programinė įranga, sukurta profesoriaus Sauliaus Gražulio, Justo Butkaus ir Andriaus Merkio. Įkėlimo svetainės programos griežtai patikrina įkeliamų duomenų sintaksę ir semantiką, taip užtikrindamos aukštą į COD patenkančių įrašų kokybę.

Darbuotojai

TRIK 2236 low

Skyriaus vedėjas prof. Virginijus Šikšnys
Tel. nr. 852234354
El. p. 

 

Mokslo darbuotojai

Dr. Giedrius Gasiūnas, 
vyresnysis mokslo darbuotojas
852234443, 

Dr. Saulius Gražulis
vyriausiasis mokslo darbuotojas
852234353

Dr. Elena Manakova
vyresnioji mokslo darbuotoja
852234353

Dr. Arūnas Šilanskas
mokslo darbuotojas
852239426
 
Dr. Tomas Šinkūnas
mokslo darbuotojas
852239428
 
Dr. Giedrė Tamulaitienė
vyresnioji mokslo darbuotoja
852234357
 

Dr. Mindaugas Zaremba
vyriausiasis mokslo darbuotojas
852234357

Dr. Tautvydas Karvelis
mokslo darbuotojas
852602111
 

Dr. Georgij Kostiuk
jaunesnysis mokslo darbuotojas
852239426
  

Dr. Giedrius Sasnauskas
vyriausiasis mokslo darbuotojas
 
Dr. Gintautas Tamulaitis
vyresnysis mokslo darbuotojas
852239428
 
 

Doktorantai

Andrius Merkys
852239423
 

Miglė Kazlauskienė
852239427

Inga Songailienė
852239448
Paulius Toliušis
852239448
 
Greta Bigelytė
 
Gediminas Drabavičius
Antanas Vaitkus
852239423
   
 
Laborantai

 

Irmantas Mogila
852239422

Dalia Smalakytė
Donata Tuminauskaitė 
Ana Tunevič
Tel. nr. 852239424
El. p.